​单细胞测序项目临床样本难获取时的替代方案你还没get？| 单细胞专题

单细胞测序主要解决的是细胞异质性问题，因此常用的样本类型为组织样本，直接采用细胞系做单细胞测序的研究比较少。对于临床研究，可选择的样本类型主要是各种肿瘤组织、癌旁组织、疾病病灶组织、健康组织器官和一些体液，主要是 PBMC，其次是腹水、胸水。样本来源主要是临床样本或者小鼠模型。小鼠模型通常只能模拟人类疾病的一个阶段，无法从病因、时间和疾病进展等方面再现人肿瘤发生发展的全过程，在此基础上开发的肿瘤治疗方案，并不能预测其临床应用的有效性。更重要的是，实验小鼠基因背景、生长环境、致病因素和用药处理均非常单一，无法应对临床多种多样肿瘤病人的复杂情况。另外很多情况下，目标临床样本很难获取到，例如现在比较热的免疫治疗，开展临床病人单细胞测序需要在治疗前后均获取到样本，难度极高，因此需要采用其他方式获得目标样本。

PDX

传统的抗肿瘤药物研究是将肿瘤细胞系接种在免疫缺陷小鼠皮下，称为 CDX 模型（cell-line-derived xenograft）。细胞系通常只从侵袭性较强的肿瘤中建立，临床上并不具有明显的复杂肿瘤异质性，用这些细胞系构建的 CDX 模型也无法保持肿瘤组织的异质性，同时由于其经过了多次的传代 ( 几十次传代 )，所以其生物学特征变化明显，从而使得其生物学特性以及药效评价结果与临床相似度极低，临床相关性不到 5%。为了解决这些问题，人们对更先进的临床前癌症模型的应用越来越感兴趣，包括病人来源的肿瘤移植 (PDX) 和基因工程小鼠 (GEM) 模型。PDX 模型是一种将病人来源的新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，依靠小鼠提供的环境生长的一种异种移植模型，这种模型保留了原代肿瘤微环境和组织病理学及遗传学特征。维持组织结构的原发性或转移性实体瘤组织通过手术或活检收集，还有一些研究使用了从恶性腹水或胸膜积液排出的液体。肿瘤以组织块或单细胞悬浮液的形式单独植入，在某些研究中还会以和基质凝胶、人成纤维细胞、间充质干细胞混合形式植入。最常见的着床部位为小鼠背侧 ( 皮下植入术 )，也可选择与原发肿瘤在同一器官着床 ( 如胰腺、口腔、卵巢、乳腺脂肪垫、大脑等 )。此外，还可以将原发肿瘤植入肾包膜，以提高移植成功率。

PDX 模型是目前为止最接近临床样本的肿瘤模型，这种模型对临床肿瘤术前评估、治疗和预后具有重要意义。通过全基因组重测序分析患者体内的基因突变，这些基因突变是肿瘤治疗的敏感位点，选用靶向这些位点的合适靶向药物有助于癌症的精准治疗。由于不同患者所携带的突变决定了患者对药物治疗的敏感性，同时一个肿瘤患者往往有多个突变位点，如何在这些潜在的靶点中明确真正有效的靶点尤为重要。为解决这个问题，PDX 模型可以作为“替身”用于药物筛选、耐药分析和预后分析。

PDX 样本单细胞文章

一、Barcoding reveals complex clonal behavior in patient-derived xenografts of metastatic triple negative breast cancer

文章题目： Barcode 显示转移性三阴性乳腺癌患者来源的异种移植物的复杂克隆行为
发表日期： 2019.2.15
发表期刊： Nature Communications
原发性三阴性乳腺癌 (TNBC) 易于扩散，但肿瘤与转移之间的亚克隆关系尚不清楚。在这里，研究人员使用细胞 Barcode 标记治疗初期的 TNBC 患者来源的异种移植 (PDXs)，通过基因组测序和高度复杂的 barcode 进行细胞克隆追踪，发现原发肿瘤及其相应转移灶之间细胞克隆结构发生了巨大改变。肿瘤切除对减少继发部位的克隆多样性具有重大影响，这表明大多数散布的肿瘤细胞缺乏播种能力，因此起源于非持续的肿瘤脱落物。切除后仍继续生长的少数克隆，即种子，在原发肿瘤中与其亲本克隆的频率没有相关性。同时用顺铂对其进行治疗，顺铂治疗了一个 BRCA1 突变的 PDX 模型，清除了 50% 的远端克隆，这种治疗方法能够缩小肿瘤和单个克隆的大小，但并没有完全杀死它们，所有的克隆包括癌症种子，最终都会再次生长，这也是癌症复发的原因。

二、乳腺癌中 EGFR 依赖性肿瘤启动的靶向治疗方案

文章题目：乳腺癌中 EGFR 依赖性肿瘤启动的靶向治疗方案

发表日期： 2017.10.31
发表期刊： Cell Reports

针对表皮生长因子受体 (EGFR) 的治疗方案在乳腺癌中有多种不可预测的反应。通过对三阴性乳腺癌 (TNBC) 患者来源的异种移植 (PDXs) 的筛选，发现了 gefitinib 响应显著的样本，对这个特殊的吉非替尼敏感患者的 3,500 个细胞进行单细胞 RNA 测序，鉴定 6 个亚群，其中 EGFR 高表达的细胞在间充质 / 干细胞样细胞群体中显著富集。分选的EGFRhi 亚群表现出强的肿瘤干细胞样特征，包括 ALDH 活性，球形成效率以及致瘤和转移潜能。EGFRhi 细胞在原发性和转移性肿瘤中产生 EGFRhi 和 EGFRlo 细胞，表明 EGFR依赖性扩增和分级状态转变。独立的 PDX 中鉴定了类似的致瘤性 EGFRhi 亚群，其中异质EGFR 表达与吉非替尼敏感性相关。这为 TNBC 患者中 EGFR 依赖性分级以及治疗干预提供了新的理解。

类器官（Organoids）

体外肿瘤细胞培养会导致肿瘤细胞丧失和肿瘤微环境中其他组分（例如成纤维细胞、脂肪细胞等）的相互作用，而肿瘤微环境对肿瘤的发生、发展、转移以及对药物处理的反应至关重要。虽然 PDX 模型可以在一定程度上模拟出人体肿瘤微环境，但一方面 PDX 移植成功率比较低，另一方面肿瘤组织在免疫缺陷小鼠形成的微环境与患者体内环境还是存在差距，可能会导致肿瘤组织发生小鼠样进化。
近年来，组织器官 3D 培养技术（或类器官）发展迅猛。类器官是指由多能干细胞、新生干细胞或成体干细胞衍生而来的三维结构，它们自发地自我组织并经历一定程度的分化，产生功能细胞类型，并有能力承担相关器官的某些功能。尽管 1992 年首次对大鼠类器官培养物进行了描述，但它们的分裂和自我维持能力有限，培养物寿命大约只有一个月。在 2009 年，Sato 等人发表了一种在基质凝胶蛋白基质中培养产生自噬类肠器官的方法。研究组通过独特的 Lgr5 基因标记鉴定了隐窝基底干细胞，并证实这些肠干细胞具有增殖为肠道所有细胞系的能力。Lgr5+ 肠干细胞在含有特定培养基成分 ( 如 Wnt、Noggin 和 R spondin) 的培养基中发生干细胞增殖分化，形成了具有增殖隐窝和高分化绒毛的类小肠结构，被命名为类器官。2011 年，Clevers 团队成功培养出直接取自人体组织的类器官，随后在 2015 年被 Batlle 团队复制。从那时起，人类的类器官培养从多种组织类型发展而来，包括结肠直肠、胃、胰腺、肝脏、乳腺、前列腺、宫颈和神经，以及肿瘤来源的组织特异性类器官。

类器官样本单细胞文章

一、Single-cell analysis reveals congruence between kidney organoids and human fetal kidney

文章题目： 单细胞分析显示肾脏类器官与人类胎儿肾脏一致
发表日期： 2019.1.23
发表期刊： Genome Medicine
人类肾脏类器官在发育研究、疾病建模和药物筛选方面具有广阔的应用前景。然而，干细胞来源的肾脏组织的效用取决于这些组织在细胞特性和复杂性水平上如何忠实地复制正常的胎儿肾脏发育。研究人员单细胞测序评估人类肾脏类器官和人类胎儿肾脏细胞组成相似型和不同。在合并的数据集中，来自于类器官和胎儿肾脏的细胞整合分析，关键的间质细胞、内皮细胞和肾细胞类型特异性 marker 在类器官和胎儿肾脏间具有转录一致性。类器官富含神经、神经胶质和肌肉祖细胞群。类器官和人体组织之间的主要转录差异可能与人为引入的技术差异有关。

二、Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells

文章题目：悬浮培养的肾脏微类器官是一种可扩展的人类多能干细胞来源的肾脏细胞
发表日期： 2019.3.1
发表期刊： Development

肾脏类器官在疾病建模、药物筛选和再生医学方面有很大的潜在应用。然而，需要新的经济有效的技术来扩大肾脏细胞类型的体外扩增。研究人员描述了一种改良的悬浮培养方法，用于从人类多能干细胞中产生肾脏类器官。优化的分化条件允许形成的微类器官，每个含有 6 到 10 个肾元，被内皮细胞和基质群体包围。单细胞转录谱证实了预期的肾细胞类型的存在和转录等价性，与先前建立的类器官培养方法一致。与静态培养相比，这种悬浮培养的微类器官方法使最终细胞产量增加了三到四倍，从而为肾脏细胞的生产提供了一种经济的方法。

相关阅读